Presentación
La distrofia muscular de Duchenne es la enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X más frecuente en los hombres, afectando a 1 de cada 3.500 niños nacidos. El inicio de la enfermedad ocurre entre los 2 y 4 años de vida, con una degeneración muscular muy severa. Existe una forma de la enfermedad, la distrofia muscular de Becker, que aparece de forma más tardía y progresa más lentamente, aunque puede llegar a ser discapacitante en la edad adulta. Tanto la distrofia muscular de Duchenne como la de Becker son causadas por mutaciones en el gen DMD.
El gen DMD, localizado en el cromosoma X, se transcribe en un mRNA de 14 kb que codifica una proteína subsarcolémica llamada distrofina. El 70% de las mutaciones del gen DMD consisten en grandes deleciones o duplicaciones de exones. El 30% restante son pequeñas alteraciones del tipo nonsense, frameshift, missense y modificaciones del splicing.
Servicios
El diagnóstico de los pacientes afectados por distrofia muscular de Duchenne o Becker es inicialmente clínico y se complementa con el análisis inmunohistoquímico y/o Western Blot de la biopsia muscular utilizando anticuerpos dirigidos contra la distrofina.
El estudio molecular del gen DMD comienza con el análisis del número de copias para determinar la presencia o ausencia de una deleción o duplicación exónica, y en caso de ser negativo, se procede a la secuenciación del ADN genómico mediante tecnología NGS para la identificación de posibles mutaciones puntuales. Si el resultado también es negativo, el paciente obtendría únicamente el diagnóstico clínico y anatomopatológico, pero no el diagnóstico genético, sin el cual no podría beneficiarse de los ensayos clínicos en desarrollo, especialmente aquellos que implican terapia génica.
El siguiente paso en el proceso diagnóstico consiste en analizar la secuencia intrónica mediante la secuenciación del ARN mensajero del gen DMD para identificar:
- Mutaciones situadas en los intrones que crean o destruyen sitios de splicing, o que originan la inserción de fragmentos intrónicos en la secuencia codificante.
- Mutaciones situadas en los exones, que son de significado incierto o que aparentemente podrían parecer inocuas, pero para las cuales la secuenciación del ARN demuestra su efecto patogénico a nivel transcripcional.
El servicio que ofrecemos incluye:
- Extracción de ARN de la biopsia muscular del paciente.
- Retrotranscripción a cDNA.
- Secuenciación mediante el método Sanger en 26 fragmentos solapados que cubren la totalidad de los 14 kb del cDNA del gen DMD.
- Análisis de las variantes identificadas: creación/eliminación de sitios de splicing, detección de transcritos alternativos, inserción de pseudoexones y valoración del posible efecto que puedan tener las variantes de significado incierto a nivel transcripcional.
Para llevar a cabo este estudio es indispensable la disponibilidad de biopsia muscular del paciente.
Responsables
Correo electrónico de contacto: pgallano@santpau.cat
Responsable Científico
Responsable Técnico / Responsable Gestor
Experiencia y Trayectoria
El diagnóstico de los pacientes afectados por distrofia muscular de Duchenne o Becker es inicialmente clínico y se complementa con el análisis inmunohistoquímico y/o Western Blot de la biopsia muscular utilizando anticuerpos dirigidos contra la distrofina.
El estudio molecular del gen DMD comienza con el análisis del número de copias para determinar la presencia o ausencia de una deleción o duplicación exónica, y en caso de ser negativo, se procede a la secuenciación del ADN genómico mediante tecnología NGS para la identificación de posibles mutaciones puntuales. Si el resultado también es negativo, el paciente obtendría únicamente el diagnóstico clínico y anatomopatológico, pero no el diagnóstico genético, sin el cual no podría beneficiarse de los ensayos clínicos en desarrollo, especialmente aquellos que implican terapia génica.
El siguiente paso en el proceso diagnóstico consiste en analizar la secuencia intrónica mediante la secuenciación del ARN mensajero del gen DMD para identificar:
- Mutaciones situadas en los intrones que crean o destruyen sitios de splicing, o que originan la inserción de fragmentos intrónicos en la secuencia codificante.
- Mutaciones situadas en los exones, que son de significado incierto o que aparentemente podrían parecer inocuas, pero para las cuales la secuenciación del ARN demuestra su efecto patogénico a nivel transcripcional.
El servicio que ofrecemos incluye:
- Extracción de ARN de la biopsia muscular del paciente.
- Retrotranscripción a cDNA.
- Secuenciación mediante el método Sanger en 26 fragmentos solapados que cubren la totalidad de los 14 kb del cDNA del gen DMD.
- Análisis de las variantes identificadas: creación/eliminación de sitios de splicing, detección de transcritos alternativos, inserción de pseudoexones y valoración del posible efecto que puedan tener las variantes de significado incierto a nivel transcripcional.
Para llevar a cabo este estudio es indispensable la disponibilidad de biopsia muscular del paciente.
Equipamiento
Equipamiento implicado en la realización del servicio:
- Tissue Ruptor (Qiagen).
- Termocicladors Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (ThermoFisher
- Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer
